1. Bakterigenoomide järjestuste arvutuslik analüüs, bakteritüvede virulentsuse ning antibiootikumi resistentsuse ennustamine genoomi järjestuse alusel.
Viimasel ajal oleme osalenud paljudes suurtes koostööprojektides, kus sekveneeritakse sadu või tuhandeid bakteri isolaate. Oleme testinud ja arendanud arvutuslikke tööriistu, mis on vajalikud nendes projektides tekkivate genoomijärjestuste analüüsiks.
Iga uuritav genoom on vaja assambleerida, seejärel teostatakse neile liigi kontroll (kas sekveneerimiseks korjati õige bakteriliik), saastuse kontroll (ega teisi liike andmetes sees ei ole), MLST tüübi määramine, tuumikgenoomi puu ehitamine, resistentsusgeenide otsimine,
resistentsusgeenide konteksti (ümbritsevate geenide) analüüs, plasmiidide olemasolu ennustamine ja plasmiidide kirjeldamine. Mõned meie töörühmas arendatud genoomide analüüsi programmid on kirjeldatud artiklites Roosaare et al., 2017 (StrainSeeker), Roosaare et al., 2018 (PlasmidSeeker) ja Aun et al., 2018 (PhenotypeSeeker).
Sellisel suuremahulisel bakterigenoomide analüüsil võib olla erinevaid bioloogilisi või meditsiinilisi eesmärke. Üheks levinumaks eesmärgiks on bakteritüvede või resistentsusgeenide leviku epidemioloogiline analüüs: saame uurida kuidas levivad bakteritüved või resistentsusgeenid naaberriikide vahel, erinevate keskkondade (virts, pinnavesi) või erinevate peremeesorganismide vahel (inimene, koduloomad, rändlinnud). Juurde saab tuua ka ajalise skaala küsides kui kiiresti bakteritüved või resistentsusgeenid piirkondade, keskkondade või peremeesorganismide vahel üle kanduvad.
Teine levinud genoomide uurimise eesmärk on funktsionaalne analüüs, mille käigus selgitatakse millised genoomi piirkonnad on loodusliku valiku surve all. Selleks paigutatakse bakterid mingisse keskkonda, kus toimub selektsioon. Seejärel sekveneeritakse mõned bakterite isolaadid, mis jäid ellu pärast selektsiooni. Neid võrreldakse genoomidega isolaatidest, mis eraldati enne selektsiooni. Sageli õnnestub tuvastada olulised muutused vaid mõnes üksikus geenis ja nii teada saada millised geenid on olulised muutunud keskkonnatingimustes ellujäämiseks. Üheks näiteks sellisest uurimistööst on Jõers et al., 2019, kus uuriti milline ainevahetusrada osaleb muropeptiidide olemasolu tunnetamisel uinuvates bakterirakkudes.
Kolmas levinud eesmärk bakterigenoomide uurimisel on nende bakterite omaduste ennustamine järjestuse alusel. Enamasti on ennustatavateks omaduseks virulentsus või resistentsus erinevatele antimikroobsetele ainetele. Selles valdkonnas oleme oma töögrupiga asunud aktiivselt arendama vastavaid ennustusmudeleid. Meie ennustusmudelite sisendiks on uuritava bakteritüve DNA järjestus, selle alusel peaks mudel suutma ennustada millistele antibiootikumidele antud bakteritüvi on resistentne. Lisaks diagnostilisele väärtusele võimaldavad sellised mudelid ka teada saada millised geenid osalevad resistentsuse tekkes. Meie tarkvara võimalustega saab tutvuda programmi PhenotypeSeeker veebilehel.
2. DNA järjestusel põhinevate diagnostiliste testide arendamine.
Oleme oma uurimisgrupis juba rohkem kui 10 aastat uurinud DNA ahelate omavahelist paardumist ja DNA ahela pikenemist polümeraasi ahelreaktsiooniga (PCRiga). DNA ahelate paardumine on aluseks paljudele molekulaarbioloogilistele meetoditele, seetõttu on oluline mõista ja ennustada milline DNA järjestus võib teistega paarduda ja kuidas see protsess täpselt realiseerub. Meie tegevus hõlmab DNA paardumise biokeemilist modelleerimist ja vastava tarkvara kirjutamist. Meie töörühm on laialt levinud praimerite disaini programmi Primer3 üks peamistest arendajatest.
Meie DNA-DNA paardumise alased teadmised leiavad praktikas kasutamist mitmesuguste PCR-il põhinevate molekulaarsete testide näol. Näiteks oleme me aidanud luua diagnostilisi teste haigustekitajate avastamiseks patsientide proovidest AS-le Quattromed HTI (praeguse nimega SynLab Eesti OÜ) ja toiduallergeenide DNA avastamise teste koostöös AS-ga Icosagen. Oleme arendanud välja diagnostilise testi vastsündinute sepsise põhjustajate leidmiseks koostöös Hollandi ettevõttega Microbiome (van den Brand et al., 2014). Hetkel on käimas töö multipleks-PCR testide arendamiseks, mis võimaldaksid Listeria monocytogenes ohtlikke tüüpe senisest kiiremini määrata.
Pikemale perspektiivile mõeldes arendame mitte ainult PCR teste, aga ka DNA sekveneerimisel põhinevaid diagnostilisi teste. DNA sekveneerimise suur eelis PCRi ees on selles, et kui PCR test võimaldab tuvastada vaid ühte patogeeni ühe testiga, siis sekveneerimine võimaldab analüüsida kõiki uuritavas proovis olevaid haigustekitajaid korraga. Eestis on DNA sekveneerimisel põhinevad testid juba mitmes kohas kasutusele võetud, üheks kuulsamaks näiteks on seni koroonaviiruste tuvastamine reoveest. Meie õppetooli panus DNA sekveneerimisel põhinevate testide arendusse on niinimetatud „signatuur-järjestuste“ leidmine igale uuritavale liigile. Signatuur-järjestused on 16-32 nukleotiidi pikkused järjestuse fragmendid mis on iseloomulikud ainult ühele uuritavale liiigile. Üheks publitseeritud näiteks selles vallas on meie töörühma artiklid Raime ja Remm, 2018 ja Raime et al., 2020, kus kirjeldame signatuur-järjestuste valimise metoodikat taimsete toidukomponentide tuvastamiseks toidu sekveneerimise andmetest.
Põhimõtteliselt on võimalk leida ka funktsionaalseid signatuur-järjestusi, mis on seotud mingi kindla biokeemilise funktsiooni või ainevahetusraja olemasoluga rakkudes. Siin on üheks näiteks antimikroobse resistentsuse tuvastamine signatuur-järjestustega. Tahaksime arendada selliseid teste ka inimese mikrobioomi uurimiseks.
3. Kiirete arvutusmeetodite arendamine inimese personaalsete genoomide analüüsiks.
Viimase viie aasta jooksul oleme koostanud mitmeid originaalseid meetodeid inimeste personaalsetest genoomijärjestustest erinevate variantide leidmiseks. FastGT (Pajuste et al., 2017) leiab 30 minutiga kõik varem kirjeldatud ühenukleotiidsed variandid ja indelid, KATK leiab kõik indiviidi erinevused referentsgenoomist ca 3 tunniga (Kaplinski et al., preprint).
Lisaks uurime ka muid variatsioone , näiteks Alu-kordusjärjestusi, mis võivad inimeste genoomides uutesse kohtadesse siseneda ja selle kaudu haigusi tekitada. Alu kordused on 300 nukleotiidi pikkused järjestused, mida on inimese genoomis ca 1 miljon. Mõned neist kordusjärjestustest on võimelised aeg-ajalt aktiveeruma ja genoomis uude kohta ümber paiknema. Oleme loonud metoodika Alu kordusjärjestuste inserteerumiste tuvastamiseks indiviidide genoomidest (Puurand et al., 2019), hetkel arendame meetodeid geenide koopia arvude (näiteks amülaasi geen) ja VNTR kordusjärjestuste (näiteks ACAN, MAO jt.) koopia arvude leidmiseks.
Meie meetodid kasutavad senistest väga erinevat lähenemist ja on seetõttu ca 30 korda kiiremad traditsiooniliselt kasutatavatest meetoditest, seejuures kaotamata täpsuses. Tarkvara kiirus on ülimalt oluline just suuremahulistes inimgenoomi uurimise projektides.
